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Modelos de terapia génica

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La identificación de genes mutantes y mecanismos responsables de los trastornos neurológicos brinda la oportunidad de considerar nuevos enfoques para su tratamiento. La identificación de productos genéticos y la delineación de la disfunción celular y la muerte celular en modelos animales pueden sugerir nuevas opciones terapéuticas. En esta revisión, nos centraremos en las enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, desafortunadamente deben excluirse varios temas intrigantes, como la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Lesch-Nyhan y los trastornos del almacenamiento lisosomal.

Enfermedad de Parkinson

Con una prevalencia del 0,1-1%, la enfermedad de Parkinson (EP) es uno de los trastornos neurodegenerativos más extendidos. La mayoría de los casos se adquieren y su causa biológica es generalmente desconocida, pero puede estar relacionada con el estrés oxidativo, la falta de soporte neurotrófico o la exposición a toxinas. La enfermedad se caracteriza por una pérdida de neuronas productoras de dopamina, específicamente, neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra que se proyectan hacia el cuerpo estriado. El temblor, la rigidez y el trastorno del movimiento son el resultado de la pérdida de la entrada inhibitoria en el sistema extrapiramidal. El tratamiento actual, la terapia oral con L-Dopa, se vuelve menos efectiva con la progresión de la enfermedad y aumenta la cantidad de efectos secundarios.

El efecto de la L-Dopa oral indica que la restauración de los circuitos neuronales no es necesaria para la mejoría, pero la administración local de L-Dopa es una terapia alternativa. La enzima tirosina hidroxilasa (TH) es responsable de la biosíntesis de L-Dopa a partir de la tirosina. Un solo gen que introduce TH en células en regiones de pérdida terminal puede, por lo tanto, aumentar el suministro local de L-Dopa ( 75 , 76 ).

Un modelo animal establecido en roedores permite probar la eficacia de la terapia génica en la enfermedad de Parkinson. La inyección de una neurotoxina, 6-hidroxidopamina, destruye las neuronas dopaminérgicas nigro estriatales y da como resultado la eliminación de la entrada dopaminérgica negra y la regulación positiva de los receptores de dopamina en el cuerpo estriado lesionado, mientras que la densidad del receptor de dopamina estriatal permanece inalterada. La asimetría causada por las sensibilidades del receptor postsináptico diferencial resultante entre el cuerpo estriado desnervado e intacto da como resultado un comportamiento rotacional después de la aplicación de apomorfina.

El suministro directo de genes del gen TH en el cuerpo estriado denervado se ha logrado con varios vectores virales. During y colegas ( 77 ) utilizaron un vector de VHS defectuoso que codifica TH y Kaplitt et al. ( 78 ) mostraron una expresión a largo plazo in vivo en animales lesionados utilizando el vector AAV. Los informes previos que usaban principalmente vectores adenovirales no fueron capaces de retener la expresión transgénica a largo plazo ( 79-82 ).

Aunque el tejido fetal ha sido efectivo en modelos experimentales y parcialmente eficaz en aplicaciones en humanos, el acceso a los tejidos y la caracterización antes del trasplante son problemáticos. Además, el trasplante de células cromafines suprarrenales no ha tenido éxito en ensayos preclínicos y clínicos ( 83 , 84 ). Actualmente, el uso de células genéticamente modificadas que producen TH es uno de los principales intereses en la terapia génica. Los fibroblastos, transfectados retroviralmente con el gen TH e implantados en el cuerpo estriado, son capaces de reducir el comportamiento rotacional inducido experimentalmente en las ratas lesionadas con 6-hidroxidopamina ( 85) Estos datos han demostrado que un pequeño número de células de injerto que producen TH son capaces de inducir mejoras de comportamiento en este modelo. Sin embargo, a pesar de la supervivencia de las células de injerto durante al menos 2 meses después de la inyección, el número de células que expresan TH disminuye con el tiempo ( 38 ). Los métodos que extienden la duración de la expresión transgénica in vivo aún no se han desarrollado.

La muerte celular en la EP se ha relacionado con el estrés oxidativo, la falta de soporte neurotrófico y la exposición a toxinas. La hipótesis de que el estrés oxidativo causa la pérdida de células trasplantadas se probó en estudios de trasplante con ratones transgénicos, que sobreexpresan Cu / Zn superóxido dismutasa (Cu / Zn-SOD). Esta enzima es crucial en la desintoxicación de radicales libres. Se ha demostrado que los ratones transgénicos que producen Cu / Zn-SOD son más resistentes al daño neuronal inducido por el estrés oxidativo. El trasplante de neuronas de ratones Cu / Zn-SOD en animales inmunodeprimidos mostró una supervivencia celular cuatro veces mayor de neuronas genéticamente modificadas con recuperación funcional concomitante después de la lesión con 6-dihidroxidopamina ( 86 ).

Enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una demencia común (prevalencia de 0.02-5%) de pacientes mayores y pertenece a un gran grupo de trastornos cerebrales degenerativos. Solo un pequeño número de casos se heredan en comparación con la gran cantidad de casos adquiridos. La neuropatología se caracteriza por demencia progresiva causada por atrofia cortical, pérdida neuronal, ovillos neurofibrilares, placas seniles y depósitos vasculares de β-amiloide en diversas regiones de la corteza cerebral y el hipocampo. β-amiloide y su precursor juegan un papel crucial en la patogénesis de la EA ( 87 , 88) La degeneración de las neuronas colinérgicas del prosencéfalo responsables de la adquisición y retención de la memoria es bien conocida, pero la causa de la pérdida celular no lo es. Un modelo bien establecido para la degeneración de las neuronas colinérgicas en roedores es creado por la lesión fénix fórnix. Esta lesión desconecta las neuronas colinérgicas del tabique medial a su suministro de NGF. La sustitución exógena de NGF en este modelo puede prevenir la degeneración de las neuronas colinérgicas y mejorar algunas formas de déficit de memoria ( 89 , 90) La infusión intraventricular directa de NGF en ratas adultas desde el momento de la lesión de la fórnix fornix impide la muerte de la mayoría de las neuronas colinérgicas axotomizadas. En el modelo Fénix Fórnix, incluso las neuronas septales no colinérgicas están destinadas a morir y probablemente no se salven con la administración de NGF ( 89 , 91 , 92 ). Sobre la base de esta observación, las infusiones de NGF en las ratas con deterioro cognitivo de edad demostraron una mejoría en las tareas de aprendizaje, en comparación con las ratas con deterioro cognitivo no infundido ( 93 ). Estudios adicionales extendieron los hallazgos, mostrando el rango de edad y la magnitud de los déficits que pueden mejorarse mediante infusiones de NGF en ratas con deterioro cognitivo de edad avanzada ( 94 , 95).) En base a estos resultados, se implantaron fibroblastos primarios, genéticamente modificados para producir NGF, en el núcleo basal magnocelular (NBM) de las ratas de edad avanzada ( 96 ). Se observó una mejoría del aprendizaje y la memoria, asociada con aumentos significativos en el tamaño y número de neuronas positivas para el receptor de NGF en el cerebro anterior basal.

Las estrategias terapéuticas para la EA también se han dirigido al reemplazo o la reposición de neurotransmisores deficientes, por ejemplo, la acetilcolina (ACh). En una evaluación del efecto del injerto sobre las deficiencias cognitivas, se implantó tejido rico en colinérgica derivado del tabique en el hipocampo de las ratas con problemas de envejecimiento ( 97 ). Cuando se compararon con ratas deficientes no injertadas, las ratas injertadas con septo mostraron una mejora significativa en las tareas espaciales. Los fibroblastos, transducidos retroviralmente para producir ACh, sobrevivieron dentro del cerebro y liberaron ACh al menos 10 días después de la implantación ( 98 ). Los fibroblastos productores de AC implantados en las cortezas frontales y parietales de ratas con lesiones bilaterales del NBM también podrían mejorar la disfunción cognitiva en un modelo de AD en ratas ( 99).) Además del prosencéfalo basal, la corteza entorrinal (EC) es una de las primeras regiones afectadas por los cambios neuropatológicos asociados con la EA. Las lesiones de la vía perforante, que conecta la CE con el hipocampo, dan como resultado la pérdida selectiva de neuronas glutaminérgicas ( 100 ). Los trasplantes de fibroblastos productores de factor de crecimiento de fibroblastos evitaron la muerte celular de las neuronas glutaminérgicas de la CE. Los modelos de rata de muerte celular similares a los que se observan en AD proporcionan antecedentes para experimentos en curso en primates no humanos, que son esenciales para evaluar el potencial clínico de estos enfoques para la terapia génica de la EA ( 101 ).

Tumores cerebrales

Los tumores cerebrales se han convertido en un objetivo principal de la transferencia de genes novedosos durante la última década, probablemente presentando el mejor modelo de una enfermedad genética adquirida. La tasa de crecimiento de las células tumorales malignas es diferente de la de las células cerebrales maduras, que son principalmente inactivas. Las células que se dividen rápidamente son teóricamente objetivos ideales para los métodos de transferencia de genes, sin la transfección del tejido cerebral circundante. Las estrategias terapéuticas actuales incluyen la destrucción directa de células tumorales, la producción de nuevos antígenos tumorales en la superficie celular para inducir el rechazo del tumor y la transferencia de genes de sensibilidad a las células tumorales.

Un gran número de modelos animales e incluso estudios clínicos recientes han aprovechado el modelo de timidina quinasa (TK) ( 43 , 102-104 ). La transfección de las células con el gen TK permite que la célula transfectada metabolice el fármaco antiviral ganciclovir (GCV) en ganciclovir-trifosfato, que es citotóxico y causa la muerte celular. Solo las células transducidas con el gen TK son sensibles al tratamiento con GCV. La pobre eficacia en el comienzo por inyección directa de vectores virales que llevan el gen TK al lecho tumoral se superó mediante la implantación de células productoras para suministrar continuamente el vector, que tiene solo un tiempo de vida media corta (2-4 h) ( 105 ) Culver et al. ( 41) demostró este enfoque inyectando tumores de glioma 9L inoculados con fibroblastos que producen retrovirus recombinantes de timidina quinasa de VHS. Usando vectores retrovirales, solo las células que se dividen rápidamente (por ejemplo, las células tumorales) se infectan y matan; la mayoría de las células quiescentes del cerebro no adoptan el gen extraño. Con el fin de lograr una cura, originalmente se pensó que el 100% de las células tumorales tendrían que transfectarse con TK y posteriormente morir por GCV. En estudios de roedores, varios grupos han visto regresión tumoral incluso con tasas de 70% y menos, debido al efecto espectador ( 106 , 107 ). El efecto espectador se basa en la observación de que las células tumorales que contienen HSV-TK en presencia de GCV son directamente tóxicas para las células tumorales adyacentes no modificadas.

Para estimular la respuesta inmune y aumentar el rechazo tumoral, se ha investigado la administración de interleucinas y factores estimulantes de granulocitos-macrófagos ( 108 , 109 ). Además, varios estudios utilizaron con éxito la respuesta inmune creciente contra tumores después de las estrategias de vacunación con células tumorales irradiadas ( 110 , Barba in prep.). En ensayos clínicos, los pacientes con tumores cerebrales primarios o metastásicos han sido tratados en estudios piloto con células productoras de HSV-TK y GCV, pero las conclusiones sólidas de estos ensayos aún no están disponibles.

Futuros retos

La determinación de los déficits bioquímicos específicos responsables de los trastornos neurológicos ha proporcionado orientación para el desarrollo de estrategias de terapia génica. Además, el conocimiento cada vez mayor de la biología celular básica, el mantenimiento ex vivo de células y las técnicas de trasplante proporcionarán vehículos más específicos para el tratamiento de enfermedades neurológicas. Los problemas técnicos en el uso de sistemas de vectores virales deben ser resueltos. La transducción y la eficacia de la infección y la expresión regulable a largo plazo son dos de los principales objetivos para el futuro. El desarrollo de sistemas de vectores lentivirales de alto título que transducen las células neuronales se suma a una creciente sensación de optimismo de que los trastornos neurológicos y los defectos pueden ser accesibles a la terapia génica.

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