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Aplicaciones de la terapia génica

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Daño Tisular Adquirido

Prevención del daño por irradiación a las SG

La radioterapia se usa para tratar la mayoría de los cánceres de cabeza y cuello. La mayoría de los pacientes reciben entre 50 y 70 Gray (Gy) de irradiación (IR), que típicamente se divide en dosis de 2 a 2.5 Gy / día, 5 días a la semana, durante 5 a 7 semanas ( Dobbs et al., 1999 ). Desafortunadamente, el tejido SG normal en el campo de IR está dañado y los pacientes sufren una morbilidad considerable por la hipofunción salival inducida por IR. El IR terapéutico genera roturas de ADN de doble cadena en las células diana y también produce estrés oxidativo a través de la generación de radicales libres potencialmente dañinos. Las células que se dividen más rápidamente (por ejemplo, las células cancerosas) generalmente se consideran más sensibles a la IR. La radiosensibilidad relativa de una célula depende del ciclo celular, siendo las células más radiosensibles en la fase G (2) -M ( Pawlik et al., 2004).) Los SG se consideran células epiteliales posmitóticas y bien diferenciadas con una velocidad de rotación lenta. Por lo tanto, se espera que los SG sean relativamente resistentes a la radio. Sin embargo, los SG son extremadamente sensibles a IR, y el mecanismo de este daño aún no está claro ( Nagler et al., 2002 ; O’Connell, 2000 ). Mientras que IR parece afectar principalmente a las células acinares, de las cuales se secreta todo el fluido, el daño celular acinar podría ser secundario a una lesión vascular localizada, edema intersticial o infiltración inflamatoria ( Vissink et al., 2003 ). Por ejemplo, hemos explorado la posibilidad de que las células endoteliales microvasculares dentro de SG sean el objetivo principal del daño por IR, un concepto sugerido por primera vez por Paris et al. (2001)en sus estudios sobre el daño de la radiación gastrointestinal. Nuestros resultados generalmente son consistentes con este concepto ( Cotrim et al., 2007 ). Esto sugiere que los esfuerzos para proteger las células microvasculares en las glándulas durante la IR pueden ser útiles para prevenir el daño de las células acinares.

Normalmente, el superóxido generado durante la IR se dismuta con tres formas de superóxido dismutasa celular a peróxido de hidrógeno, que luego se metaboliza mediante catalasa y glutatión peroxidasa en agua y oxígeno ( Epperly et al., 2004 ; Oberley y Buettner, 1979 ). Curiosamente, Greenberger y Epperly (2007) han demostrado que la administración de liposomas de superóxido dismutasa-plásmido de manganeso (MnSOD-PL) puede proporcionar protección IR de la mucosa en el pulmón, el esófago, la cavidad oral, la vejiga urinaria y el intestino. Aunque los efectos de MnSOD-PL en la función SG no se han estudiado, este enfoque para evitar el daño por SG de IR parece prometedor.

Reparación de Daño SG de IR

Un enfoque importante de nuestro trabajo ha sido restaurar la función SG en pacientes que ya recibieron IR. Para este objetivo, nuestra estrategia ha utilizado la transferencia del DNA complementario de aquaporin-1 (AQP1) (cDNA). AQP1 fue la primera proteína de canal de agua descubierta ( Preston y Agre, 1991 ). Los SG presentes en el campo IR muestran una dramática pérdida de células acinares; las células acinares se consideran epitelios secretores permeables al agua. Las células ductales normalmente sobreviven al IR, pero se consideran epitelios de absorción relativamente impermeables al agua. Razonamos que las células del conducto en un SG dañado por IR podrían generar un gradiente osmótico suficiente para permitir el movimiento del agua en una dirección basal a apical, es decir, hacia el lumen ( Delporte et al., 1997).) Especulamos que el gradiente estaría basado en la formación de bicarbonato de potasio en la luz: potasio que ingresa a la luz a cambio de un protón a través de un intercambiador de potasio-protón presente en las membranas apicales de las células ductales. Además, supusimos que todo lo que faltaba para que las células del conducto secretaran fluido en una glándula dañada por IR era una vía de permeabilidad al agua facilitada, una proteína del canal de agua.

Construimos un vector Ad5 que codifica AQP1 humana (AdhAQP1) y demostramos que este vector conduce a un aumento dramático en la secreción de fluidos cuando se administra 90 o 120 días después de IR en ratas ( Delporte et al., 1997 ) o cerdos en miniatura ( Shan et al. , 2005 , Tabla 4 ), a ~ 80% de los niveles de control cuando se midieron 3 días después de la transducción. Un vector de control Ad5 no tuvo ningún efecto significativo sobre el flujo salival. Además, después de la administración de AdhAQP1 a SG, no se observaron efectos toxicológicos significativos, es decir, en múltiples valores de química clínica y hematología medidos ( Zheng et al., 2006) En base a estos resultados agregados, desarrollamos un protocolo de ensayo clínico de fase 1 (seguridad del vector con algunas medidas de eficacia) para evaluar AdhAQP1 en pacientes que recibieron IR para cáncer de cabeza y cuello al menos 5 años antes. Aunque los vectores Ad5 solo conducen a la expresión génica transitoria, debido a la respuesta inmune generada, elegimos este tipo de vector porque se sabe muy poco sobre la fisiología de las células ductales humanas. Suponemos que las células de los conductos humanos generalmente serán similares a las de las ratas y los cerdos en miniatura, es decir, que también pueden generar un gradiente osmótico y un flujo de fluidos como se describió anteriormente. Sin embargo, no lo sabemos. En el caso de que las células ductales humanas sean incapaces de esta respuesta, la presencia de AdhAQP1 en el tejido estará relativamente limitada debido a la respuesta inmune, que consideramos una importante consideración de seguridad en ausencia de cualquier beneficio. Sin embargo, si las SG humanas irradiadas son capaces de secretar fluido después de la transferencia del gen AQP1, hemos desarrollado un vector AAV2 capaz de mediar la expresión de AQP1 a largo plazo y, presumiblemente, proporcionar a los pacientes la reparación de SG estable requerida. Este vector incluye el mismo promotor, el ADNc de AQP1 y la señal de poliadenilación como AdhAQP1 (Braddon et al., 1998 ).

Infecciones del Tracto GI Superior

Aunque se han logrado avances rápidos en la detección, manejo y biología del VIH-1, incluso hoy en día, la candidiasis oral sigue siendo una infección oportunista común observada en pacientes inmunosuprimidos. En pacientes infectados por VIH-1, esto puede conducir a una morbilidad significativa ( Sroussi et al., 2007 ). Los medicamentos antifúngicos tipo azole son la principal herramienta de gestión para tales infecciones por cándida. Sin embargo, la aparición de especies de Candida resistentes a azol requiere el desarrollo de estrategias de tratamiento alternativas.

Las histatinas son una familia de péptidos catiónicos ricos en histidina compuestos de hasta 38 aminoácidos. Son secretados por los SG de humanos y algunos primates y son un componente principal del sistema de defensa no inmune del anfitrión innato en la cavidad oral contra bacterias e infecciones fúngicas. La importancia de las histatinas en la candidiasis resistente a los azoles es doble. Los niveles de histatina en la saliva se reducen en pacientes infectados por VIH-1. En segundo lugar, el mecanismo de acción de las histatinas en la búsqueda de especies de Candida es claramente diferente del de las drogas de tipo azol. Mientras que los fármacos azólicos inhiben la síntesis de ergosterol, un esterol de membrana plasmática principal ( Amerongen et al., 2002), las histatinas actúan uniéndose al ergosterol presente en la membrana fúngica. Razonamos que la transferencia del ADNc de histatina-3 a SG daría como resultado un aumento de la secreción de histatinas en la cavidad oral ( O’Connell et al., 1996 ) y sería útil en el manejo de especies de Candida resistentes a azol.

En estudios con modelos animales, expresamos con éxito histatin-3 en SG de rata usando un vector Ad5 (AdCMVH3). La concentración de histatina-3 en saliva de glándula submandibular de rata recogida de ratas tratadas 3 días después de la transducción con AdCMVH3 fue tan alta como 1 mg / ml, con un valor medio de 302 μg / ml. La actividad fungicida de la histatina-3 recombinante mediada por el vector AdCMVH3 se probó in vitro en un ensayo de muerte en el tiempo. A una concentración de 100 μg / ml, se sacrificó el 90% de Candida albicans resistente a azol en 60 minutos ( O’Connell et al., 1996 ).

Trastornos autoinmunes

El síndrome de Sjogren (SS) es la segunda enfermedad autoinmune más común en los Estados Unidos y afecta entre 1 y 4 millones de personas, principalmente mujeres (~ 90%). La etiología de SS no está clara, y el tratamiento actual es solo paliativo. La SS se caracteriza por la presencia de una infiltración focal de células linfoides en las glándulas salivales y lagrimales, aunque también pueden estar involucrados otros órganos ( Pillemer et al., 2001 ). En ausencia de tratamientos convencionales adecuados, hemos sugerido que la terapia génica puede ser beneficiosa para los pacientes con SS. Tenemos la hipótesis de que la transferencia de genes inmunomoduladores en SG puede reducir la sialoadenitis autoinmune y conducir a un aumento de la salivación, así como al alivio sintomático ( Kok et al., 2003) Por ejemplo, la transferencia de genes que codifican citocinas antiinflamatorias como la interleucina-10 (IL-10) o el péptido intestinal vasoactivo (VIP; Lodde et al., 2006 ) podría conducir a una disminución en la expresión de citoquinas proinflamatorias, y por lo tanto , proteger SG y preservar su función secretora.

Para probar esta hipótesis, utilizamos un modelo animal común de SS, el ratón femenino no obeso diabético (NOD). Entregamos los ADNc humanos (h) IL-10 y VIP usando vectores AAV2 porque proporcionan una expresión transgénica estable con poca reactividad inmune. Tanto AAVhIL-10 como AAVhVIP, así como un vector de control, AAVLacZ que codifica β-galactosidasa, se administraron localmente mediante canulación retrógrada de las glándulas submandibulares. Comparamos el flujo salival y la sialoadenitis ~ 8-12 semanas más tarde. La administración de AAVhIL-10 condujo a la preservación de las tasas de flujo salival, así como a la reducción de la sialoadenitis autoinmune focal ( Tabla 5 ; Kok et al., 2003).) La administración de AAVhVIP también dio como resultado una preservación del flujo salival; sin embargo, no se observó reducción de la sialoadenitis focal con este transgén ( Lodde et al., 2006 ).

Estos estudios iniciales muestran que la transferencia de genes inmunomoduladores puede ser útil en el tratamiento de la sialoadenitis autoinmune y la hipofunción salival resultante que se produce en pacientes con SS. Sin embargo, dado que no entendemos la patogénesis de SS, esta estrategia de transferencia de genes es inespecífica y aún requiere un estudio considerable.

Deficiencias sistémicas de proteínas

Como se mencionó anteriormente, los SG muestran varias características que son comunes a muchas glándulas endocrinas, particularmente la capacidad de producir altos niveles de proteína para exportar y la capacidad de secretar proteínas al torrente sanguíneo. Hemos sugerido una aplicación terapéutica para aprovechar estas características: el tratamiento de los trastornos sistémicos por deficiencia de proteína única ( Baum et al., 2004 ). El tratamiento actual de estas afecciones implica la administración regular de una proteína recombinante mediante inyección en bolo (p. Ej., Insulina para diabetes mellitus y eritropoyetina [Epo] para anemias relacionadas con insuficiencia renal crónica). Por ejemplo, muchos de nuestros estudios han implicado transferir el cDNA para Epo ( Voutetakis et al., 2004 ; Voutetakis et al., 2007;) Epo se produce en las células epiteliales del riñón y se secreta por la vía secretora constitutiva en el torrente sanguíneo. En SG, después de la transferencia de genes, mucho Epo también se secreta en el torrente sanguíneo ( Tabla 6 ).

Para la mayoría de nuestros experimentos, hemos utilizado vectores AAV2 que codifican Epo humano o rhesus (AAV2hEpo; AAV2rhEpo) para transferir el ADNc de Epo a los SG de ratones y macacos rhesus. Después de que los ratones machos recibieron 10 9 partículas de AAV2hEpo en sus glándulas submandibulares, la Epo sérica alcanzó los niveles máximos en 8 a 12 semanas y se mantuvo relativamente estable durante 54 semanas (el tiempo más largo estudiado). Los niveles de hematocrito se incrementaron de manera similar. En ratones machos, Epo se secreta casi por completo en el torrente sanguíneo (160: 1, Tabla 6 , Voutetakis et al., 2004 ). Después de la entrega de AAV2rhEpo (3 × 10 11partículas / glándula) a las glándulas parótidas de macacos rhesus, la expresión de rhesus Epo aumentó significativamente después de 1 semana, y los niveles se mantuvieron relativamente estables en el suero y la saliva después de 6 meses (el tiempo más largo estudiado). Cuando se midieron los niveles de Epo rhesus total, la mayoría de Epo rhesus también se encontró en el suero, pero a una relación mucho más baja que la encontrada en ratones (relación suero / saliva 7: 1). Si bien aún existe la necesidad de comprender qué dirige la selección de proteína secretora transgénica en suero o saliva, parece de nuestros estudios que el uso de SG como órgano de depósito diana para la transferencia génica para tratar trastornos sistémicos de deficiencia de proteína única tiene un potencial clínico significativo.

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