Skip to content

Aplicaciones de la terapia génica al SNC

terapia genica SNC

La terapia génica es un nuevo método con potencial para tratar una amplia gama de enfermedades neurológicas adquiridas y heredadas, donde se ha identificado el defecto o deleción del gen causante. Además del reemplazo génico, la aplicación de productos genéticos que reducen la disfunción celular o la muerte representan nuevas opciones terapéuticas. En este artículo se revisarán las técnicas de transferencia génica para expresar proteínas nuevas usando diferentes vectores virales in vitro e in vivo , así como modelos animales y ensayos en humanos. Nos centraremos en un nuevo vector lentiviral como método reciente de transferencia génica y trastornos degenerativos del SNC, y sus sistemas modelo relacionados.

La manipulación genética del sistema nervioso central (SNC) ha progresado desde la biología molecular y celular hasta un amplio campo de experimentos en mamíferos e incluso en ensayos clínicos limitados. La tecnología actual permite la expresión de nuevos productos génicos o la sobreexpresión de proteínas endógenas. La reparación del sistema nervioso con sus estructuras complejas y diversos tipos de células presenta un campo que es extremadamente desafiante pero potencialmente susceptible a las estrategias actuales de terapia génica. Los vectores virales, con su capacidad de introducir ADN o ARN en la célula huésped utilizando la maquinaria celular para la supervivencia y la replicación, son el método preferido de transferencia de genes en las células diana del SNC. A pesar de los avances recientes, persisten los problemas técnicos, como la necesidad de dirigir específicamente el gen extraño a los tejidos o células apropiados,

Actualmente hay dos enfoques principales para realizar la terapia génica somática, las estrategias ex vivo e in vivo . En el enfoque ex vivo , la transferencia génica se realiza en cultivo celular ( in vitro ) y la célula se trasplanta al organismo. En el enfoque in vivo , el gen se administra directamente en un organismo para la transferencia génica in situ a las células. El aumento del conocimiento sobre el huésped y la célula donante, las condiciones para su mantenimiento en cultivo y las técnicas de trasplante, ha llevado a la conclusión de que la terapia génica no solo se aplica a enfermedades genéticas sino también a muchos trastornos o traumas adquiridos en el SNC.

Vectores virales

Los virus pueden considerarse como parásitos celulares que requieren la función de la célula huésped para vivir y duplicarse. Dependiendo de la familia viral, el ADN o ARN codifica un conjunto limitado de proteínas virales, encerradas en una cápside que está rodeada o no por un recubrimiento lipídico. Las proteínas virales integradas en la capa externa interactúan con los receptores celulares. El tropismo de diferentes virus para células diana específicas se debe a las diferencias en los recubrimientos de proteínas virales. Por lo tanto, los virus transfieren sus genes a las células hospedadoras y utilizan la maquinaria celular para la replicación y generación de virus de progenie.

Los vectores virales son virus modificados diseñados para contener un gen de interés que normalmente está flanqueado por secuencias virales que codifican señales para empaquetamiento y expresión. Típicamente, los vectores virales tienen una replicación defectuosa y son capaces de una sola ronda de infección de la célula huésped sin diseminación viral. La transferencia génica puede ser transitoria, con el transgén permaneciendo como un episoma, o estable, con integración del genoma viral en el ADN de la célula huésped. Tras la infección por vectores virales adeno y herpes simplex (HSV), por ejemplo, el transgén se pierde con el tiempo por dilución durante la división celular.

Sin embargo, los vectores víricos retrovíricos y adenoasociados (AAV) pueden insertar de forma estable las secuencias virales, incluido el gen de interés, en el cromosoma del huésped. La integración estable de genes extraños produce una alteración permanente del genoma en la célula transducida y su progenie ( Fig. 2).) Para integrarse en el genoma de la célula hospedadora, los vectores retrovirales simples, como los vectores derivados del virus de la leucemia murina de Moloney, necesitan la descomposición de la membrana nuclear que se produce durante la división celular. La principal limitación de los vectores retrovirales radica en la exclusión de las células no diferenciadas diferenciadas terminalmente como las neuronas, el hígado y las células musculares. El vector AAV, aunque se integra en el genoma de células hospedadoras de células en división y no en división, tiene una eficacia limitada y depende de la función viral auxiliar, proporcionada por el virus adeno o herpes simple, para ser eficaz en la transducción. Sin embargo, los lentivirus, por ejemplo el virus VIH, una subclase de retrovirus, permiten la transducción estable de células que no se dividen.

La eficacia de la expresión transgénica y la persistencia de vectores virales en general dependen del promotor que impulsa el transgén y también de la respuesta inmune del huésped. La respuesta inmune puede estar dirigida contra el producto transgénico mismo y / o cualquier proteína viral sintetizada en la célula transducida. Evitar la expresión de genes virales puede permitir la supervivencia a largo plazo de las células transducidas.

Vectores del virus del herpes simple

El VHS es un gran virus ADN de 150 kb que contiene aproximadamente 70 genes, que no son necesarios para el crecimiento en el cultivo celular. Muchos vectores de VHS usados ​​son unidades de recombinación competentes y básicamente concentradas del plásmido original, lo que permite un único inserto del gen de interés. Por el contrario, los vectores de HSV de amplicón defectuosos tienen múltiples copias del gen de interés que se empaquetan en viriones de HSV. Las neuronas y las células gliales pueden transducirse, pero el VHS claramente tiene una mayor eficacia en la transducción de neuronas. Una vez que el virus HSV infecta la célula huésped, la cápside se libera en el citoplasma y se transporta al núcleo, donde el ADN viral ingresa a través del poro nuclear. Las partículas víricas de la progenie son producidas y liberadas por la célula infectada e infectan a otras células, dando como resultado la lisis celular o latencia en la célula huésped.

Esquema de las estrategias de transferencia de genes in vivo y ex vivo. La estrategia in vivo usa vectores virales previamente probados en cultivos celulares para inyección directa en el sistema nervioso central. Los vectores víricos inyectados se integran en las células huésped (in situ) donde el efecto bioquímico se analiza mediante pruebas bioquímicas, fisiológicas y / o de comportamiento. El enfoque ex vivo utiliza células explantadas, poblaciones clonales o heterogéneas, infectadas con vectores virales. Las células transducidas se cultivan luego a números suficientes para la implantación en el tejido diana. Después del trasplante, se realizan pruebas bioquímicas, fisiológicas y de comportamiento para determinar la eficacia de la transferencia de genes.

Esquema de las estrategias de transferencia de genes in vivo y ex vivo. La estrategia in vivo usa vectores virales previamente probados en cultivos celulares para inyección directa en el sistema nervioso central. Los vectores víricos inyectados se integran en las células huésped (in situ) donde el efecto bioquímico se analiza mediante pruebas bioquímicas, fisiológicas y / o de comportamiento. El enfoque ex vivo utiliza células explantadas, poblaciones clonales o heterogéneas, infectadas con vectores virales. Las células transducidas se cultivan luego a números suficientes para la implantación en el tejido diana. Después del trasplante, se realizan pruebas bioquímicas, fisiológicas y de comportamiento para determinar la eficacia de la transferencia de genes.

Las construcciones de vectores HSV se han usado con promotores virales y no virales e insertos de genes extraños en cerebro de ratón ( 5 ) e hipocampo de rata ( 6 ). Los picos transitorios de expresión después de la inoculación y la pérdida de expresión se informaron después de 2 semanas ( 7 , 8) La pérdida de expresión transgénica se debe a la desactivación del promotor o a la respuesta inmune del huésped. Las estrategias actuales de tumores cerebrales utilizan mutantes del vector HSV que se atenúan para el crecimiento en células que no se dividen, pero se replican dentro de las células tumorales en crecimiento. La división celular permite que el virus ingrese en una célula tumoral, haga copias múltiples, mate la célula y se disemine a células tumorales adicionales. El tejido cerebral circundante contiene células que no se dividen y, por lo tanto, no puede soportar la replicación ( 9) Estos estudios en animales inmunodeprimidos han mostrado resultados prometedores; sin embargo, el tratamiento debe ser reevaluado en el contexto de un sistema inmune competente. Aunque el VHS tiene un amplio rango de huéspedes y es posible la transferencia de genes en muchos tipos de células cultivadas, el uso generalizado de este enfoque de transferencia se restringirá hasta que se resuelvan los problemas relacionados con la propagación del vector in vivo . Además, será necesario eliminar las funciones citotóxicas inducidas por virus, incluidas las necesarias para la replicación lítica ( 10 ).

Vectores adenovirales

Los adenovirus, que son virus de ADN bicatenarios lineales, contienen aproximadamente 36 000 pares de bases encapsulados en un recubrimiento de proteína. Los vectores adenovirales transducen transitoriamente células que no se dividen con alta expresión de proteínas virales, causando una respuesta patogénica por linfocitos T citotóxicos (CTL) ( 11 ). Varios informes han documentado la expresión de un transgén durante hasta 8 semanas después de la inyección en el cerebro, y durante más de 6 meses en animales fetales e inmunodeprimidos ( 12 , 13).) Los vectores adenovirales están disponibles en dos formas diferentes que son deficientes en replicación y reducidas en su potencial oncogénico. El primer vector carece de dos genes virales tempranos (E1A, E1B), que están implicados en la progresión del ciclo de la célula huésped. En algunos constructos adenovirales, se eliminó la región E3, que inhibe la citólisis de la célula infectada mediante CTL, y el factor de necrosis tumoral (TGF-α) ( 14 ). A pesar de estas manipulaciones, un número creciente de experimentos con vectores adenovirales en el cerebro ha revelado una respuesta inmune significativa debido a la expresión restante de proteínas virales ( 12 , 15).) La segunda generación de vectores adenovirales difiere de la primera generación en que la región E3 solo se elimina parcialmente. El vector conserva la expresión de la proteína E3-19 kDa, responsable de la capacidad de supresión inmune de los adenovirus, y posteriormente reduce la respuesta inmune ( 16 ). Todavía este vector continúa expresando genes virales a bajos niveles y a menudo conduce a una respuesta inflamatoria ( 17 ), muerte de células infectadas y pérdida rápida de expresión transgénica. Para desarrollar una tercera generación de vectores adenovirales, se desea la eliminación de la región E4, que puede causar la transformación oncogénica en la célula huésped ( 18 ). Sin embargo, la eliminación de E4 causa una reducción drástica de la expresión transgénica ( 19 ).

Figura 2
Transducción in vivo de células del SNC de rata adultas. Se muestran imágenes microscópicas confocales de secciones de cerebros inyectados con adenovirus (AD), virus adenoasociados (AAV), virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) y vector viral de la inmunodeficiencia humana (VIH). Las secciones se tiñen mediante inmunofluorescencia para β-gal (un gen informador), NeuN (un marcador neuronal específico) y GFAP (proteína ácida fibrilar glial). Las imágenes obtenidas de cada tinción individual así como una imagen fusionada de las tres tinciones se muestran para cada tratamiento según se indica.
Ver diapositiva de descarga grande
Transducción in vivo de células del SNC de rata adultas. Se muestran imágenes microscópicas confocales de secciones de cerebros inyectados con adenovirus (AD), virus adenoasociados (AAV), virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) y vector viral de la inmunodeficiencia humana (VIH). Las secciones se tiñen mediante inmunofluorescencia para β-gal (un gen informador), NeuN (un marcador neuronal específico) y GFAP (proteína ácida fibrilar glial). Las imágenes obtenidas de cada tinción individual así como una imagen fusionada de las tres tinciones se muestran para cada tratamiento según se indica.

Vectores virales adenoasociados

Los virus adeno-asociados (AAV), que son parvovirus de ADN monocatenarios, no son patógenos para los mamíferos. En vectores AAV, todas las secuencias codificantes virales, excepto las secuencias mínimas de AAV requeridas para la transducción, pueden eliminarse, reduciendo los efectos nocivos de la expresión de proteína viral. Los vectores AAV permiten la integración en el genoma de la célula huésped, pero la eficacia es muy baja. Los estudios de cultivos celulares inmortalizados y primarios han demostrado que la gran mayoría de los genomas del vector AAV permanecen episomales y no integrados ( 20 , 21 ). Los virus auxiliares, ya sea el adenovirus o HSV, proporcionan proteínas que son necesarias para la traducción y la transcripción del AAV y desempeñan un papel similar durante la transcripción del virus auxiliar ( 21).) Un estudio reciente ha demostrado que la región adenoviral E4 es el paso limitante en el ciclo de vida de AAV, específicamente en la segunda síntesis de ADN de cadena ( 22 ). Para una transducción eficiente, sin embargo, el papel de los virus auxiliares necesita ser dilucidado aún más. Los virus auxiliares pueden tener implicaciones importantes para el uso de vectores AAV en protocolos de terapia génica, ya que los pacientes tratados con virus recombinantes pueden infectarse posteriormente con virus auxiliares de tipo salvaje y la interacción de virus recombinantes es poco conocida ( 23 ). Los bajos títulos de los vectores y la eficacia de la transducción y la dependencia de los virus auxiliares parecen limitar el uso de AAV.

Vectores retrovirales

Los retrovirus se descubrieron como agentes oncogénicos, aunque la gran mayoría de los retrovirus no causa ninguna patología. Estos virus oncogénicos transforman las células mediante la expresión de secuencias oncogénicas virales originalmente transducidas a partir de genomas de células hospedadoras o mediante la integración cerca de oncogenes celulares con la activación posterior del oncogén huésped ( 24 ). Su amplio rango de hospedadores y su capacidad para transportar genes extraños e integrarse establemente en el genoma de la célula huésped los convierten en vectores ideales para la transferencia de genes ( 24).) Las construcciones de vectores retrovirales, basadas en el virus de la leucemia murina de Moloney (MLV), se reducen significativamente en su genoma viral y no expresan ninguna proteína viral que pueda provocar la respuesta inmune del huésped. El gen de interés está flanqueado por secuencias virales mínimas que actúan como señales para el empaquetamiento y la transcripción retroviral. Las proteínas virales, gag, pol y env, se pueden suministrar en trans en líneas celulares de empaquetamiento para generar vectores retrovirales. La especificidad de la célula huésped de los vectores retrovirales puede aumentarse reemplazando el gen de la envoltura ecotrópica con genes de envoltura anfotrópica ( 25).) Aunque los retrovirus proporcionan un método eficiente para la administración de genes estables, existen dificultades para obtener títulos elevados de vectores sin el riesgo de recombinación y producción de partículas víricas competentes para la replicación ( 26 ).

A diferencia de otros vectores virales que pueden haber sido atenuados pero conservan cierta capacidad para infectar otras células, los vectores retrovirales deficientes en replicación infectan solo una vez y no se diseminan in vivo . Los vectores retrovirales tienen un amplio rango de células hospedadoras, pero su uso se limita a las células en división ( 27 , 28 ). Como la división celular está limitada en el sistema nervioso central, la aplicación de este sistema se limita principalmente a experimentos ex vivo .

Para dirigirse a las células no diferenciadas diferenciadas terminalmente, especialmente las neuronas del SNC, se ha desarrollado un nuevo sistema de vectores basado en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Al igual que otros lentivirus, el VIH puede infectar a las células en división y quiescentes, como los macrófagos derivados de monocitos y las células en crecimiento ( 29 ). El secuestro de la maquinaria de importación nuclear, el genoma del VIH y su gen de interés se transportan activamente a través del poro nuclear ( 30-33 ). El vector derivado del VIH no expresa la envoltura del virus VIH pero usa la envoltura proteica del virus de estomatitis vesicular (VSV G), que aumenta la estabilidad y permite títulos altos durante la preparación del vector. La administración de genes usando este vector ha sido probada mediante inyección intracerebral de vectores altamente concentrados (108 TU / ml) en el cuerpo estriado y el hipocampo de ratas adultas. Tres meses después de la inyección, el gen informador (β-galactosidasa) todavía era detectable en cada sitio de inyección y las neuronas diferenciadas terminalmente se transdujeron ( 34 ) ( figura 2 ). No se detectaron cambios patológicos evidentes o signos de respuesta inmune en el tejido cerebral de rata. En comparación, los animales de control a los que se les inyectó un vector retroviral basado en MLV no expresaron el gen informador de β-galactosidasa después de 6 semanas. La expresión transgénica a largo plazo, la integración estable y la falta de expresión de las proteínas víricas asociadas con las respuestas inmunes hacen que este vector sea una herramienta atractiva en la terapia génica del SNC.

noticias terapia genica

Noticias